ISSN 2500-2236
DOI-prefix: 10.18527/2500-2236
ОБЗОР

Новая безопасная и эффективная живая модифицированная холодоадаптированная вирусная вакцина против гриппа лошадей, позволяющая дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных

Аннотация


В настоящей работе дается анализ основных преимуществ и недостатков применяемых на практике инактивированных и живых вакцин против гриппа лошадей. Впервые обобщены наиболее значимые сведения, касающиеся разработки новой живой модифицированной холодоадаптированной вирусной вакцины против гриппа лошадей на основе штамма А/HK/Otar/6:2/2010. Обсуждается ряд уникальных свойств разработанной вакцины, о которых ранее не сообщалось, в сравнении с аналогичными вакцинами против гриппа лошадей. К числу подобных свойств вакцины относятся: продолжительный (не менее 12 месяцев) протективный иммунитет после однократной вакцинации; стерильный иммунитет после двукратной вакцинации; перекрестная защита от гетерологичного вируса через 12 месяцев после двукратной вакцинации; дифференциация инфицированных животных от вакцинированных.

Abstract


An analysis of the main advantages and shortcomings of the existing inactivated and live vaccines against the equine influenza viruses is given in this paper. For the first time, the most important information, concerning the development of a new live modified cold-adapted equine influenza virus vaccine based on the A/HK/Otar/6:2/2010 strain is summarized. We discuss a number of unique features of the developed vaccine that have not previously been reported, and compare the new vaccine with the existing equine influenza vaccines. The properties of developed equine vaccine include: long lasting (12 months or more) protective immunity after a single immunization; sterile immunity after double vaccination; cross-protection against the heterologous virus in 12 months after a double vaccination and the differentiation of infected animals from vaccinated animals.

Обзор


Грипп лошадей – остро протекающая контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся катаральным воспалением органов респираторного тракта, общим угнетением, кратковременной лихорадкой и сухим болезненным кашлем, а в тяжелых случаях – развитием пневмонии. Среди известных подтипов вируса гриппа лошадей (ВГЛ) Н7N7 и Н3N8 наиболее распространенным считается Н3N8, который представляет серьезную угрозу для здоровья лошадей, а также экономическую проблему для коневодства [1]. В настоящее время наиболее эффективным способом борьбы против этой инфекции является специфическая профилактика, которая осуществляется с помощью инактивированных и живых вакцин.

Инактивированные вакцины, содержащие целые вирусные частицы или их субъединицы, начиная с 1960-х годов были широко внедрены в ветеринарную практику. Главное достоинство данного типа вакцин заключается в их безопасности вследствие отсутствия вирусной репликации [2]. При этом наиболее значимыми недостатками инактивированных вакцин являются слабая иммуногенность, обусловленная формированием исключительно гуморального иммунного ответа, а также непродолжительный иммунитет, вызывающий необходимость многократного введения препарата [3, 4, 5]. Например, для формирования у лошадей гуморального иммунитета продолжительностью 12 месяцев требуется трехкратная иммунизация инактивированными вакцинами (первые две – с интервалом в 4-6 недель и третья – на 5-6 месяце) [3, 4, 5], поскольку сформированные при этом противовирусные IgG(T) антитела являются короткоживущими (не более 100 дней после вакцинации) [6]. Критичным в подобной схеме иммунизации является еще и то, что между вторым и третьим введением инактивированных вакцин лошади наиболее уязвимы и в полевых условиях могут быть инфицированы вирусом гриппа [7]. К тому же некоторые инактивированные вакцины с адъювантами (фосфат или гидроокись алюминия) вызывают у привитых (внутримышечно) животных нежелательные явления, которые преимущественно характеризуются воспалительными реакциями и болевыми ощущениями в месте введения препарата [8]. Подобная реакция связана еще и с тем, что для накопления вакцинных вирусов в технологическом процессе производства инактивированных вакцин традиционно используются куриные эмбрионы, и даже после очистки вируса в составе вакцины, как правило, остается значительное количество яичного белка, который при многократном внутримышечном введении может оказывать реактогенное действие [2].

На фоне перечисленных недостатков инактивированных вакцин против гриппа лошадей наиболее обнадеживающие результаты, особенно в плане эффективности, демонстрируют живые аттенуированные вакцины. Среди них особое место занимают препараты, приготовленные на основе холодоадаптированных (ca) штаммов. Суть данного типа вакцины заключается в том, что ca штаммы ВГЛ, обладая способностью эффективно репродуцироваться в верхних дыхательных путях, не размножаются при повышенной температуре нижних дыхательных путей, где репликация дикого вируса обычно сопровождается развитием воспалительных процессов (бронхит, пневмония) [9]. Подобным образом у привитых лошадей воспроизводится легкая форма естественной гриппозной инфекции, которая в дальнейшем приводит к образованию противовирусного гуморального и клеточного иммунного ответов. Кроме того, вакцина из ca штамма, в отличие от инактивированных препаратов, способна формировать у привитых животных перекрестно реагирующий Т-клеточный иммунитет, что весьма важно в связи с антигенной изменчивостью (антигеный дрейф) вирусов гриппа лошадей [10]. Описанный подход к созданию живой вакцины против гриппа лошадей из ca штамма впервые с успехом применен в США. С 1999 года в этой стране лицензирована и широко применяется живая ca модифицированная вакцина (Flu Avert® I.N., Heska Corporation), вводимая интраназально [11]. В своем составе эта вакцина содержит ca штамм A/equine/Kentucky/1991 (H3N8) североамериканского происхождения, но она также может обеспечивать защиту от ВГЛ подтипа H3N8 европейской линии. Несмотря на то, что вакцина Flu Avert® не стимулирует высокий уровень гуморального ответа, однократное введение этой вакцины вызывает более продолжительную защиту от инфекции (не менее 6 месяцев), чем инактивированные вакцины. Кроме того, у животных, привитых этой вакциной, образуются иммуноглобулины класса А, так называемые секреторные антитела, способные нейтрализовать болезнетворный агент в самой ранней стадии развития инфекционного процесса в верхних дыхательных путях [9]. Однако при всех преимуществах данного типа вакцин существуют некоторые опасения относительно их безопасности, что связано с риском возможной реверсии вакцинного вируса или его реассортацией с циркулирующим вирусом дикого типа в организме лошади с последующим появлением новых патогенных вирусов [2]. Хотя указанные опасения имеют под собой основу, все же более чем 20-летний положительный практический опыт применения живой интраназальной аттенуированной гриппозной вакцины у людей в России, а с недавних пор и в странах Северной Америки и Западной Европы (FluMist®), исключает подобную вероятность [2]. Что же касается вакцинных ca штаммов ВГЛ, то здесь отсутствие случаев реверсии или реассортации объясняется следующим образом. Экспериментально подтверждено, что ca штаммы ВГЛ способны не только проявлять стабильность фенотипа температурочувствительности (ts) in vivo на протяжении пяти последовательных пассажей от лошади к лошади, но также подавлять репликацию вируса дикого типа в верхних дыхательных путях лошадей [10]. Интересно, что ca вакцина против ВГЛ может быть использована для терапии гриппозной инфекции у лошадей [11, 12].

Еще одним профилактическим препаратом, нашедшим применение на практике (впервые лицензирован в странах Европейского Союза в 2003 году), является живая вакцина на основе рекомбинантного вируса оспы канарейки (canarypox) (ProtegFlu, Merial Ltd., Великобритания) [2]. Данная вакцина включает два вирусных вектора на основе вируса canarypox, кодирующих гемагглютинины (НА) ВГЛ штаммов A/equine/Newmarket/2/93 (H3N8) (европейская линия) и A/equine/Kentucky/94 (H3N8) (американская линия). В отличие от инактивированных вакцин она способна формировать у привитых лошадей как гуморальный (включая секреторные IgA антитела), так и клеточный иммунные ответы [13, 14]. Однако, как и в случае инактивированных вакцин, для формирования у лошадей протективного иммунного ответа продолжительностью 12 месяцев необходимо трехкратное введение этой вакцины (первые два – с интервалом в 35 дней и третье – на 6-м месяце) [15]. Более того, ввиду наличия в составе этой вакцины адъюванта Carbormer 974P, она нередко приводит к местным нежелательным явлениям у привитых лошадей [16, 17]. Наиболее критичным в отношении данного типа вакцины является то, что у привитых животных уже после первой вакцинации образуется напряженный иммунитет к используемым вирусным векторам, который при повторном введении тех же вирусных векторов препятствует их репродукции и, следовательно, экспрессии чужеродных белков [2, 17, 18]. Для преодоления данного барьера по отношению к векторным вакцинам против гриппа лошадей Breathnach et al. [19] успешно применили перекрестную схему иммунизации. Суть данной схемы заключалась в том, что первичная вакцинация лошадей проводилась ДНК-вакциной, кодирующей НА и нуклеопротеидный белок от штамма A/equine/Kentucky/1/81 (H3N8), а последующая вакцинация (на 6-й и 10-й неделе) – модифицированным вирусом vaccinia Ankara, кодирующим те же самые белки. Однако данная схема вакцинации, ввиду ее сложности и низкой производительности, не нашла применения на практике.

Таким образом, если не брать в расчет вакцины, которые пока находятся только на стадиях разработки или внедрения в практику (ДНК вакцины [20, 21], живые аттенуированные гриппозные вирусные вакцины, полученные методом обратной генетики [22, 23]), в настоящее время широкое практическое применение нашли лишь инактивированные, живые ca и векторные вакцины против гриппа лошадей. Поэтому при решении задачи по созданию безопасной и эффективной вакцины против ВГЛ подтипа Н3N8 в Казахстане, где в 2007 году была зарегистрирована крупная вспышка этой болезни (заболело около 200 тысяч лошадей, из них пало 50 тысяч, в том числе 40 тысяч молодняка [24]), мы делали выбор из вышеперечисленных препаратов. При дальнейшем детальном анализе преимуществ и недостатков указанных вакцин мы пришли к выводу, что с точки зрения баланса между такими показателями, как безопасность, эффективность, продолжительность иммунитета при однократном введении, доступность и высокая производительность технологии, а также цена конечного продукта, наиболее предпочтительной для разработки в Казахстане является живая ca вакцина.

В основе успеха разработки первой казахстанской живой модифицированной ca вакцины против гриппа лошадей стояло получение вакцинного штамма. Данная задача решалась в сотрудничестве с Научно-исследовательским институтом гриппа (НИИ гриппа, Санкт-Петербург, Россия) с использованием метода классической генетической реассортации. В результате этой работы был получен новый вакцинный ca штамм А/HK/Otar/6:2/2010, несущий гены, кодирующие поверхностные белки (HA, NA) от дикого штамма A/equine/Otar/764/2007 (Н3N8, американская линия Флорида, клайд 2), и гены, кодирующие внутренние белки (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) от донора аттенуации – ca штамма A/Hong Kong/1/68/162/35 (Н3N2). Выбор дикого штамма A/equine/Otar/764/2007 (Н3N8) для конструирования вакцинного вируса обусловлен тем, что он был выделен во время последней эпидемии гриппа лошадей 2007 года в Казахстане и, следовательно, сохраняет актуальность для этой страны. Более того, филогенетически по гену НА данный вирус имеет 99.99% гомологии со штаммом A/equine/Richmond/1/2007 (Н3N8), который рекомендован Международным эпизоотическим бюро (МЭБ) для производства вакцины против гриппа лошадей [25]. Отдельного внимания заслуживает ca штамм A/Hong Kong/1/68/162/35 (Н3N2), который был использован в качестве донора аттенуации. Отличительной чертой этого штамма является то, что полученные с его помощью вакцинные штаммы характеризуются не только безопасностью и эффективностью, но и высокой репродуктивностью в системе культивирования. Так, титр инфекционной активности штамма A/HK/Otar/6:2/2010, культивируемого в куриных эмбрионах при соблюдении оптимальных условий (доза вируса, температура и продолжительность инкубации), стабильно составляет не менее 9.0 log10 ЭИД50/мл (неопубликованные данные). На основе данного ca штамма A/Hong Kong/1/68/162/35 (Н3N2) можно без особого труда и за короткий промежуток времени получать новые вакцинные штаммы и актуализировать состав существующих живых гриппозных вакцин. Свидетельством этого является тот факт, что данный штамм с успехом был использован для получения таких вакцинных штаммов, как A/Saint Petersburg/HK/2009 (H1N1), А/Astana/HK/2009 (H5N1) и А/Perth/HK/2011 (H3N2) [26]. Следует отметить, что подобным преимуществом не обладает наиболее близкий и единственный коммерческий аналог – вакцина Flu Avert®. Этот коммерческий препарат создавался на основе дикого штамма A/equine/Kentucky/1991 (Н3N8), для аттенуации которого было проведено 49 пассажей в куриных эмбрионах при температуре 26°С. Значит, для актуализации вакцинного штамма этим способом потребуется провести аналогичную работу с диким ВГЛ, которая займет не менее года [11]. Для сравнения, при использовании метода классической реассортации, где в качестве донора аттенуации выступает ca штамм A/Hong Kong/1/68/162/35 (Н3N2), на процесс актуализации вакцинного штамма уходит не более трех месяцев. Предыдущими исследованиями [27] было показано, что вакцинный штамм A/HK/Otar/6:2/2010 сохраняет ca и ts фенотипы, а также проявляет генетическую стабильность на протяжении 20 последовательных пассажей в куриных эмбрионах. Более того, продемонстрирована полная безопасность этого вируса для лабораторных животных (мыши и морские свинки) [28]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что новый реассортантный ca штамм A/HK/Otar/6:2/2010 является хорошим кандидатом для живой модифицированной ca вакцины против гриппа лошадей.

Дальнейшие испытания разработанной вакцины на жеребятах и жеребых кобылах также продемонстрировали ее безопасность, так как у животных, привитых однократно интраназально в дозе 2 х 109.2 ЭИД50, в течение всего срока наблюдения (21 сутки) не проявлялось признаков какой-либо болезни, включая температурные реакции. Было отмечено лишь незначительное выделение вакцинного вируса (100,75-1,0 ЭИД50/мл) у 12,5-50% привитых жеребят и жеребых кобыл на 1-е и 3-е сутки после вакцинации. Начиная с 7 суток после вакцинации, у привитых животных формировались секреторные антиген-специфичные IgA антитела, а с 14 суток после вакцинации – Т-клеточный иммунный ответ. Интересно, что у привитых жеребят и жеребых кобыл в течение 28-суточного наблюдения (до контрольного заражения штаммом А/equine/Otar/764/2007 (Н3N8) в дозе 108 ЭИД50/животное) в сыворотке крови не обнаруживались антитела к ВГЛ подтипа Н3 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментном анализе (ИФА). Однако при этом у привитых животных наблюдалась выраженная клиническая (по интенсивности и продолжительности признаков болезни, оцениваемых по бальной системе) и вирусологическая (по титру вируса в назальных смывах на 1-14 сутки после контрольного заражения) защита от гомологичного дикого штамма A/equine/Otar/764/2007 (Н3N8) по сравнению с контрольной группой [29].

Наибольший интерес представляют результаты изучения продолжительности протективного иммунного ответа у лошадей после первичной и повторной иммунизации живой ca вакциной против гриппа лошадей подтипа H3N8. Мы впервые продемонстрировали возможность этой вакцины формировать у лошадей клиническую и вирусологическую защиту от гомологичного вируса дикого типа A/equine/Otar/764/2007 (H3N8) в течение 12 месяцев после однократной интраназальной иммунизации [30]. Ранее сообщалось, что данный тип вакцины (коммерческая вакцина Flu Avert®, Heska Corporation) формирует у однократно привитых лошадей протективный иммунный ответ продолжительностью 6 месяцев [2, 9].

Интересен и тот факт, что двукратное интраназальное введение лошадям вакцины с интервалом в 42 дня может не только существенно повысить их клиническую и вирусологическую защиту от вируса дикого типа по сравнению с однократным режимом вакцинации, но и индуцировать стерильный иммунитет (отсутствие вируса в назальных смывах животных после контрольного заражения) на протяжении трех месяцев после повторной иммунизации [30]. Подобные результаты по созданию у лошадей стерильного иммунитета против гриппа ранее были достигнуты с помощью схемы иммунизации, запатентованной компанией Intervet International B.V., Boxmeer (NL) [31]. Согласно этому методу для достижения стерильного протективного иммунитета необходимо сначала вакцинировать лошадей живой ca вакциной, а затем – с интервалом не менее 8 недель – провести повторную иммунизацию инактивированной вакциной против гриппа лошадей. О возможности создания стерильного иммунитета у лошадей после контрольного заражения сообщалось также в отношении живой векторной вакцины на основе вируса canarypox, содержащей адъювант Carbopol [32]. Однако сведения о формировании стерильного протективного иммунного ответа у лошадей после двукратного применения только лишь живой ca вакцины против гриппа лошадей сообщаются впервые. Еще одним преимуществом двукратной вакцинации по сравнению с однократной является ее способность индуцировать у лошадей выраженную клиническую и вирусологическую защиту от гетерологичного вируса дикого типа A/equine/Sydney/2888-8/2007 (Н3N8) через 12 месяцев после повторной иммунизации [30]. Сравнительный анализ полученных результатов и литературных данных [5, 15, 33, 34] показал, что по созданию продолжительного протективного иммунного ответа у лошадей живая аттенуированная вакцина из реассортантного ca штамма A/HK/Otar/6:2/2010 превосходит все известные коммерческие вакцины (инактивированные и рекомбинантные векторные) против гриппа лошадей. Полученные результаты дают основание полагать, что разработанная вакцина может составить хорошую альтернативу инактивированным и рекомбинантным векторным вакцинам, применяемым в Казахстане и других неблагополучных по гриппу лошадей странах.

Согласно рекомендациям МЭБ, вакцинные препараты против гриппа лошадей должны не только быть безопасными и иммуногенными, но и по возможности обеспечивать дифференциацию инфицированных животных от вакцинированных (Differentiating Infected from Vaccinated Animals, DIVA стратегия) [35]. В настоящее время этим требованиям в полной мере отвечают лишь живые рекомбинантные векторные вакцины, экспрессирующие отдельные поверхностные белки вируса гриппа [36]. В случае применения традиционных инактивированных вакцин также можно дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных с помощью серологических тестов, выявляющих антитела к неструктурному белку NS1 вируса гриппа [37]. Указанные антитела образуются лишь в случае репликации живого вируса гриппа в организме животного. В отношении живых аттенуированных вакцин против гриппа лошадей стратегия DIVA практически невыполнима, так как вакцинный вирус, подобно вирусу дикого типа у привитых животных, вызывает инфекционный процесс. Однако наши серологические исследования наглядно демонстрируют возможность дифференциации инфицированных животных от вакцинированных при применении живой модифицированной вакцины из ca штамма A/HK/Otar/6:2/2010 [30]. Суть дифференциации заключается в том, что после первичной, а главное – после повторной иммунизации лошадей данной вакциной у животных в течение 12 месяцев после вакцинации не обнаруживались детектируемые титры (> 1:10) антител в РТГА. Однако на 28-е сутки после контрольного заражения гомологичным (A/equine/Otar/764/2007 H3N8) или гетерологичным (A/equine/Sydney/2888-8/2007 Н3N8) вирусами во всех группах однократно или двукратно иммунизированных лошадей в различные сроки после вакцинации (через 1, 2, 4, 5, 6, 9, 12 месяцев) выявлялись значительные титры антител в РТГА, среднегеометрические (СГТ±95% доверительный интервал) значения которых составляли от 168±27 до 672±144. Полученные данные дают основание полагать, что разработанная вакцина позволяет дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных с помощью такого широко распространенного и доступного серологического теста, как РТГА. Следует отметить, что подобные данные в отношении живых ca противогриппозных вакцин сообщаются впервые.

Завершающим этапом цикла лабораторных исследований, нацеленных на разработку вакцины, было проведение комиссионных испытаний вакцины для проверки физических и иммунобиологических характеристик, а также технологии изготовления в условиях пилотного производства. По сути, результаты данной работы создают предпосылки для дальнейшего полевого испытания вакцины и ее внедрения в производство. Для этого по разработанной технологии была приготовлена пилотная серия вакцины в объеме 13 400 ампул (134 000 доз). Результаты технологического и биологического контроля показали, что по таким параметрам качества, как внешний вид, наличие посторонней примеси, вакуум в ампулах, растворимость, рН, массовая доля влаги, стерильность, инфекционная активность, безвредность и иммуногенность, вакцина полностью отвечает требованиям (спецификации продукции) проекта нормативной документации препарата. Результаты проведенных комиссионных испытаний в дальнейшем позволили представить, согласовать и утвердить в установленном порядке комплект нормативно-технической документации на биопрепарат [38].

Таким образом, в результате комплексных исследований, начиная от получения вакцинного штамма и завершая комиссионными испытаниями технологии изготовления и свойств препарата, разработана новая безопасная и эффективная модифицированная ca вирусная вакцина против гриппа лошадей, которая по ряду свойств существенно превосходит другие коммерческие препараты. Учитывая большой потенциал разработанной вакцины для внедрения в практику, в 2016-2017 годах планируется провести полевые испытания этой вакцины в условиях коневодческих хозяйств Казахстана.

Результаты и Обсуждение

Благодарности


Исследования проводились при финансовой поддержке Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан в рамках научной программы O.0534 «Грипп лошадей: эпизоотологический мониторинг, разработка средств специфической профилактики и диагностики» на 2010-2012 гг. по направлению: «Разработка высокоэффективных средств специфической профилактики гриппа лошадей».

Конфликт интересов


Автор не имеет какого-либо отношения к организациям с финансовыми интересами или финансовыми конфликтами по предметам или материалам, обсуждаемым в настоящей статье, включая работы, услуги консультантов, гонорары, акции, свидетельства экспертов, гранты или патенты, как полученные, так и находящиеся на рассмотрении, или лицензионные платежи. При подготовке рукописи не была использована никакая помощь в написании.

Цитирование


Табынов КК. Новая безопасная и эффективная живая модифицированная холодоадаптированная вирусная вакцина против гриппа лошадей, позволяющая дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных. MIR J, 2016; 3(1), 49-55, doi: 10.18527/2500-2236-2016-3-1-49-55.


© 2016 Табынов. Эта статья публикуется в свободном доступе в соответствии с лицензией Creative Commons AttributionNonCommercial-ShareAlike 4.0 International Public License (CC BY-NC-SA), которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любых носителях при условии, что указываются автор и источник публикации, а материал не используется в коммерческих целях.

Литература


1.            Cullinane A, Elton D, Mumford J. Equine influenza – surveillance and control. Influenza Other Respir Viruses 2010; 4(6), 339–344.

2.            Paillot R, Hannant D, Kydd JH, Daly JM. Vaccination against equine influenza: Quid novi? Vaccine 2006; 24(19), 4047-4061.

3.            Morley PS, Townsend HG, Bogdan JR, Haines DM. Efficacy of a commercial vaccine for preventing disease caused by influenza virus infection in horses. J Am Vet Med Assoc 1999; 215, 61–66.

4.            Mumford JA, Wood J. Establishing an acceptable threshold for equine influenza vaccines. Dev Biol Stand 1992; 79, 137–146.

5.            Heldens JGM, Pouwels HGW, van Loon AAWM. Efficacy and duration of immunity of a combined equine influenza and equine herpesvirus vaccine against challenge with an American-like equine influenza virus (A/equi-2/Kentucky/95). Vet J 2004; 167, 150–157.

6.            Nelson KM, Schram BR, McGregor MW, Sheoran AS, Olsen CW, Lunn DP. Local and systemic isotype-specific antibody responses to equine influenza virus infection versus conventional vaccination. Vaccine 1998; 16(13), 1306-13.

7.            Newton JR, Lakhani KH, Wood JLN, Baker DJ. Risk factors for equine influenza serum antibody titres in young Thoroughbred racehorses given an inactivated vaccine, Prev Vet Med 2000; 46, 129–141.

8.            Wilson WD. Equine influenza. Vet Clin North Am Equine Pract 1993; 9(2), 257-82.

9.            Townsend HG, Penner SJ, Watts TC, Cook A, Bogdan J, Haines DM, Griffin S, Chambers T, Holland RE, Whitaker-Dowling P, Youngner JS, Sebring RW. Efficacy of a cold-adapted, intranasal, equine influenza vaccine: challenge trials. Equine Vet J 2001; 33(7), 637–43.

10.          Chambers TM, Holland RE, Tudor LR, Townsend HG, Cook A, Bogdan J, Lunn DP, Hussey S, Whitaker-Dowling P, Youngner JS, Sebring RW, Penner SJ, Stiegler GL. A new modified live equine influenza virus vaccine: phenotypic stability, restricted spread and efficacy against heterologous virus challenge. Equine Vet J 2001; 33(7), 630–6.

11.          Dowling PW, Youngner JS. Cold-adapted equine influenza viruses. Patent No. US 7,438,919 B2, USA, 2008.

12.          Youngner JS, Whitaker-Dowling P, Chambers TM, Rushlow KE, Sebring R. Derivation and characterization of a live attenuated equine influenza vaccine virus. Am J Vet Res 2001; 62(8), 1290-4.

13.          Breathnach CC, Rudersdorf R, Lunn DP. Use of recombinant modified vaccinia Ankara viral vectors for equine influenza vaccination. Vet Immunol Immunopathol 2004; 98(3-4), 127-36.

14.          Adams AA, Sturgill TL, Breathnach CC, Chambers TM, Siger L, Minke JM, Horohov DW. Humoral and cell-mediated immune responses of old horses following recombinant canarypox virus vaccination and subsequent challenge infection. Vet Immunol Immunopathol 2011; 139(2-4), 128-40.

15.          Minke JM, Toulemonde CE, Coupier H, Guigal PM, Dinic S, Sindle T, Jessett D, Black L, Bublot M, Pardo MC, Audonnet JC. Efficacy of a canarypox-vectored recombinant vaccine expressing the haemagglutinin gene of equine influenza H3N8 virus in the protection of ponies from viral challenge. Am J Vet Res 2007; 68(2), 213–9.

16.          Heldens JG, Patel JR, Chanter N, Ten Thij GJ, Gravendijck M, Schijns VE, Langen A, Schetters TP. Veterinary vaccine development from an industrial perspective. Vet J 2008; 178(1), 7–20.

17.          Rooney JF, Wohlenberg C, Cremer KJ, Moss B, Notkins AL. Immunization with a vaccinia virus recombinant expressing herpes simplex virus type 1 glycoprotein D: long-term protection and effect of revaccination. J Virol 1988; 62(5), 1530-4.

18.          Kanesa-thasan N, Smucny JJ, Hoke CH, Marks DH, Konishi E, Kurane I, Tang DB, Vaughn DW, Mason PW, Shope RE. Safety and immunogenicity of NYVAC-JEV and ALVAC-JEV attenuated recombinant Japanese encephalitis virus-poxvirus vaccines in vaccinia-nonimmune and vaccinia-immune humans. Vaccine 2000; 19(4-5), 483-91.

19.          Breathnach CC, Rudersdorf R, Lunn DP. Use of recombinant modified vaccinia Ankara viral vectors for equine influenza vaccination. Vet Immunol Immunopathol 2004; 98(3-4), 127-36.

20.          Lunn DP, Soboll G, Schram BR, Quass J, McGregor MW, Drape RJ, Macklin MD, McCabe DE, Swain WF, Olsen CW. Antibody responses to DNA vaccination of horses using the influenza virus hemagglutinin gene. Vaccine 1999; 17(18), 2245-58.

21.          Soboll G, Nelson KM, Leuthner ES, Clark RJ, Drape R, Macklin MD, Swain WF, Olsen CW, Lunn DP. Mucosal co-administration of cholera toxin and influenza virus hemagglutinin-DNA in ponies generates a local IgA response. Vaccine 2003; 21(21-22), 3081-92.

22.          Quinlivan M, Zamarin D, García-Sastre A, Cullinane A, Chambers T, Palese P. Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein. J Virol 2005; 79(13), 8431-9.

23.          Maeda Y, Hatta M, Takada A, Watanabe T, Goto H, Neumann G, Kawaoka Y. Live bivalent vaccine for parainfluenza and influenza virus infections. J Virol 2005; 79(11), 6674-9.

24.          Karamendin K, Kydyrmanov A, Kasymbekov Y, Khan E, Daulbayeva K, Asanova S, Zhumatov K, Seidalina A, Sayatov M, Fereidouni SR. Continuing evolution of equine influenza virus in Central Asia, 2007–2012. Arch Virol. 2014, 159, 2321–7.  doi: 10.1007/s00705-014-2078-3.

25.          OIE Expert Surveillance Panel on Equine Influenza Vaccine Composition, OIE Headquarters, 4 March 2016. Available: http://www.oie.int

26.          Потапчук МВ, Репко ИА, Сергеева МВ, Коротков АВ, Комиссаров АБ, Сандыбаев НТ, Червякова ОВ, Хайруллин БМ, Цыбалова ЛМ. Характеристика реассортантных штаммов вируса гриппа на основе нового донора A/HongKong/1/68/162/35 (H3N2). Вопросы вирусологии 2012; 57(6), 42-6.

27.          Chervyakova OV, Strochkov VM, Tailakova ET, Sultankulova KT, Sandybayev NT, Sansyzbay AR, Gorev NE, Sergeeva MV, Potapchuk MV, Repko IA, Tsybalova LM, Kiselev OI. Recombinant Strain A/HK/Otar/6:2/2010 (H3N8) for development of a live intranasal equine influenza vaccine. J Equine Vet Sci 2014; 34(6), 749–758.

28.          Асанжанова НН, Табынов КК, Кыдырбаев ЖК, Рыскельдинова ШЖ, Кожамкулов ЕМ, Инкарбеков ДА. Изучение безвредности и иммуногенности клонов реассортантного штамма A/HK/Otar/6:2/2010 (H3N8) вируса гриппа на модели лабораторных животных. Биотехнология. Теория и практика 2012; 1, 69-76.

29.          Tabynov K, Kydyrbayev Z, Ryskeldinova S, Assanzhanova N, Kozhamkulov Y, Inkarbekov D, Sansyzbay A. The safety and immunogenicity of a novel cold-adapted modified-live equine influenza virus vaccine. Aust Vet J 2014; 92(11), 450-457.

30.          Tabynov K, Kydyrbayev Z, Ryskeldinova S, Assanzhanova N, Sansyzbay A. Duration of the protective immune response after prime and booster vaccination of yearlings with a live modified cold-adapted viral vaccine against equine influenza. Vaccine 2014; 32(25), 2965-71.

31.          Van de Zande S. Prime boost vaccine for the protection of equines against equine influenza. Patent No. US 7,601,502 B2, USA, 2009.

32.          Minke JM, Audonnet JC, Jessett DM, Fischer L, Guigal PM, Coupier H, Pardo MC, Taylor J, Tartaglia J, Mumford JA. Canarypox as vector for influenza and EHV-1 genes: challenges and rewards, In: 2nd International Veterinary Vaccines and Diagnostics Conference, Oxford 2000; 36.

33.          Cullinane A, Weld J, Osborne M, Nelly M, McBride C, Walsh C. Field studies on equine influenza vaccination regimes in Thorough-bred foals and yearlings. Vet J 2001; 161(2), 174–185.

34.          Heldens JG, Pouwels HG, Derks CG, Van de Zande SM, Hoeijmakers MJ. Duration of immunity induced by an equine influenza and tetanus combination vaccine formulation adjuvanted with ISCOM-Matrix. Vaccine 2010; 28(43), 6989-96.

35.          OIE Terrestrial manual, Chapter 2.5.7. – Equine influenza (Infection with equine influenza virus), May 2016. Available: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.07_EQ_INF.pdf

36.          Daly JM, Newton JR, Mumford JA. Current perspectives on control of equine influenza. Vet Res 2004; 35(4), 411-23.

37.          Ozaki H, Sugiura T, Sugita S, Imagawa H, Kida H. Detection of antibodies to the nonstructural protein (NS1) of influenza A virus allows distinction between vaccinated and infected horses. Vet Microbiol 2001; 82(2), 111–119.

38.          Табынов КК, Асанжанова НН, Рыскельдинова ШЖ, Кожамкулов ЕМ, Инкарбеков ДА, Кыдырбаев Ж. Комиссионные испытания технологии изготовления, физических и иммунобиологических характеристик новой живой холодоадаптированной вакцины против гриппа лошадей. Биотехнология. Теория и практика 2016; 1, 33-40.